Иммунологические методы исследований

Это  диагностические лабораторные  методы, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител.  Широко  используются  для  выявления  возбудителей  инфекционных  и паразитарных  заболеваний,  определения гормонов,  беременности,  видовой принадлежности  белков,  опухолевых  антигенов,  диагностики  аутоиммунных   болезней,     для  определения  групп  крови  и  совместимости  переливаемой  крови.  Иммунологические  исследования  позволяют  не только  идентифицировать  различные  вирусные, бактериальные или   паразитарные заболевания,  но  также  определять  титры  антител к ним,  что  позволяет   оценивать   устойчивость  организма  к  отдельным  видам  инфекционных  болезней и  прогнозировать  их  развитие.   С  помощью  иммунологических  методов  изучают  иммунитет  по отношению к массовым инфекциям,  например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

В  основе  этих  методов  исследований  лежит  реакция  «антиген-антитело»   с  образованием  иммунных  комплексов,  которые  можно  обнаружить  в  сыворотке  крови  (в  пробирке)  различными  методами.

Антиген - это вещество, которое «узнается» организмом животного как чужеродное, и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию.  Антигенами  могут  быть  бактерии, вирусы,  грибы, паразиты,  а  также  любые другие  вещества  из  внешней  или  внутренней  среды   (пыльца растений,    белки  трансплантатов   тканей   и  органов,  поверхностные  белки клеток крови при  ее  переливании  и  другие  соединения).  В  некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов.    Одним  из  главных  способов,   с  помощью  которого  организм  защищается  от  проникновения  антигенов,   является  выработка  антител.  

Антитела   (иммуноглобулины — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)  - это белки, которые образуются клетками организма животного в ответ на внедрение в него антигена.   Антитела образуются  против не  всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившие название антигенных детерминант. Наиболее важным свойством антител является их способность специфически (то есть избирательно) связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело «узнает» и связывается только с  одним  определенным антигеном.  Кроме  этого  возможно  получение  искусственным  путем  антител,  которые  будут  специфически  связываться  с  другими  антителами, что  широко  используется  для  создания  различных  диагностических  тест систем.  Сыворотка  крови,  содержащая  антитела  к  другим  антителам  называется  антисывороткой. 

Таким  образом,  высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа. 

С  помощью  иммунологических  исследований  решаются  две  основные  задачи:

1. Определение  антигенов.  Когда  неизвестным  компонентом  реакции  является антиген. Для его  обнаружения в  исследуемом  материале  используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие  высокоспецифичные  антитела, которые  были  получены от животных после их вакцинации определенными антигенами. 
2. Определение  антител.  В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препаратами, используемыми в качестве антигена в  иммунологических  или,  как  их  еще  называют, серологических реакциях). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных  к  примененному антигену.

При   исследовании  антител  к  инфекционным  заболеваниям,  например  к  лептоспирозу  или  токсоплазмозу,  достоверные результаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала  анализируют кровь  больного,   взятую  в первые дни заболевания. Затем, через 10 – 14 дней, изучают повторную пробу  и  на  основании  динамики нарастания антител  ставят  окончательный  диагноз. 

 Иммунологические  реакции  протекают  в  две  фазы:

1. Специфическое связывание   антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут.
2. Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов антиген-антитело.  Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов.

Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс.

В  зависимости  от  механизма  и  учета результатов   иммунологические методы  исследования  подразделяют  на:   реакции,  основанные  на  явлении  агглютинации;  реакции,  основанные  на явлении преципитации;  реакции с участием комплемента;  реакции нейтрализации,  реакции с использованием химических и физических методов (иммуноферментный  и  иммунофлюоресцентный  анализы).

Реакция  агглютинации. 

В этой  реакции  антигенами  являются  крупные  частицы  - микробные  клетки,  эритроциты, лейкоциты  и  т.д.,  которые склеиваются антителами и выпадают в осадок  на дно пробирки  в  виде  иммунных комплексов в форме хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом.   Это  возможно  благодаря особенностям строения  молекулы  антител, которые  имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух “ветвей”. Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены.   Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок.  На  этом  основано  определение  групп  крови и  совместимости  переливаемой  крови  перед  гемотрансфузией,  когда  эритроциты  склеиваются  антителами  той  или  иной  специфичности. 

При  диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух направлениях:

1.  определяют вид выделенного от больного животного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки,  содержащей  специфические  антитела;
2.  обнаруживают антитела в сыворотке больного животного, используя стандартный микробный диагностикум,  включающий  антигены.  Титром агглютинирующей  сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.

Для  обнаружения   лептоспироза  у  животных  и  человека  используют  реакцию  микроагглютинации  (РМА), которую  проводят    на специальных  планшетах  в  микрообъемах.  При  этом  легко наблюдать  образование клеточного  осадка  на  дне  лунки.

Отличаясь  чувствительностью,  реакция  агглютинации  также  используется  для  идентификации  антител  к  растворимым,  мелкодисперсным  антигенам.   В  этом  случае  она  называется  реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации  (РНГА).   Для  этого  антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах или частицах латекса.  Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки крови, содержащей антитела к данному антигену.

Реакция  преципитации.

Преципитация  или  осаждение  иммунных  комплексов  происходит   вследствие взаимодействия антител с растворимыми антигенами.   В  результате  чего  происходит  их  агрегация, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата).  Различные разновидности реакции преципитации  проводят  либо  в  жидкой  среде,  либо  чаще  всего  в  твердых  гелях агара.  Метод,  основанный на  реакции  преципитации,  также  называется  методом  иммунодиффузии. 

Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки, вырезанные  в  агарозном  геле, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.   Этот  метод   используется  для  диагностики  инфекционного  гепатита  у  животных. 

Иммунологические  методы  с  использованием  химических  и  физических  меток. 

Эти  методы  обладают  высокой  чувствительностью  и  специфичностью,  и  нашли  широкое  применение  в  лабораторной диагностике болезней  животных  и  человека. 

Иммунофлюоресцентный анализ   основан на использовании  антител  меченных флюоресцирующими веществами  (флюорохромами).  Меченые антитела связываются с антигеном, образуя  иммунные комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.  Этот  метод  часто  используют  в  иммуногистохими,  т.е.  для  определения  локализации антигена  в  клетках  и тканях.  При  этом  можно  установить  распределение  антигена  в  тканях  и  клетках.  С  другой  стороны  иммунофлуоресценция  позволяет  обнаружить  антитела,  направленные  к  известному  антигену  данной  ткани  или  клетки.  Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа:  прямой, непрямой  и  конкурентный. 

Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для выявления антигенов, например,  вирусов в зараженных клетках,  обнаружения бактерий и риккетсий в мазках, а также различных клеточных антигенов. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета.

Непрямая иммунофлюоресценция  -     материал,  содержащий  известный  антиген, переносят  на предметное стекло  и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки крови для образования иммунных комплексов, а затем после отмывания не связавшихся реагентов выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей антисывороткой. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. 

Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

Иммуноферментный  анализ - наиболее  надежный,  экономичный  и  высокочувствительный  метод,  применяемый  для  количественной  оценки  антител  и  антигенов.  Его  отличает  простота проведения реакции, возможность инструментального учета и автоматизации всех ее этапов.

Внедрение  в  лабораторную  практику  иммуноферментного  анализа   позволило   значительно   расширить  возможности  диагностики  инфекционных  заболеваний,  аутоиммунных   и  гормональных  нарушений. 

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

ИФА  основан на использовании антител, конъюгированных или связанных с ферментами, в  основном   пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой.  Комплексы  антител  с  ферментами  называются  конъюгатами.  Механизм  реакции  при  определении  антигена  заключается в  следующем:

На твердый носитель, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют  антитела к искомому  веществу  или  инфекционному  агенту. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. Затем  несорбированные белки отмывают специальным раствором и в лунки добавляют  исследуемый  материал, например  сыворотку  крови,  где  находятся  искомые  антигены (вирусы  или  бактерии и т.д.).  Антитела, закрепленные на пластиковой подложке, «подбирают» антигены, присутствующие в крови пациента, специфически  с  ними  связываясь.  Затем добавляют антитела, связанные с ферментом - конъюгаты. Оставшиеся молекулы сформируют «сэндвич», состоящий из следующих слоев: фиксированное на подложке антитело —антиген — связанное с ферментом антитело.

Чтобы обнаружить  образовавшиеся иммунные  комплексы, т.е. соединения  меченых  антител с антигенами,  добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к антителам ферментом.  После добавления в данную систему хромогенного субстрата последний расщепляется ферментом конъюгата, в результате чего изменяется цвет раствора в лунке.

Интенсивность окрашивания пробы исследуемого материала прямо пропорциональна содержанию в ней искомого антигена. Учет интенсивности реакции опытных и контрольных проб проводят  на  основании  измерения  оптической  плотности на специальных  приборах  - спектрофотометрах.  Чем выше оптическая плотность  в данной ячейке, тем большее количество специфических антител содержится в пробе.

Описанная  выше  последовательность  проведения  реакции  называется  «сандвич» вариантом  ИФА. 

В  случае,   когда  неизвестным  компонентом    является  антитело,  первая реакция происходит между искомым  антителом   и очищенным антигеном возбудителя,  фиксированным  на  поверхности лунок планшета.   Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую реакцию, в которой в качестве антигена выступает специфически  связавшееся  антитело, а в качестве антител к нему — конъюгат.  Это  вариант  непрямого  иммуноферментного  анализа.  Например,  с  помощью  этого  вариант  ИФА  определяют  антитела  к  токсоплазмозу - паразитарному заболеванию кошек, собак и человека.

В  последнее  время   все  более  широкое  распространение  в  ветеринарии  получили  экспресс-тесты  диагностики  инфекционных  заболеваний.   Экспресс-тесты  не требуют специальной длительной  подготовки  проб, просты  в применении,   отсутствует  необходимость  в  использовании  дополнительных  реагентов  и  оборудования, поскольку все иммунореагенты находятся в составе тест-кассеты. время  исполнения анализа  не  более  -  15-25 минут. И в то же время этот метод достаточно надежен - достоверность достигает 92-98%.  Их  можно  применять в  любом  месте:  в кабинете, при  выезде  на  дом, в лаборатории. Иммунохроматографические диагностические методы являются позднейшей разработкой, отвечающей всем требованиям, и наиболее широко используемыми в мире диагностическими экспресс-методами.  

От наличия возможности быстро обнаружить возбудителя  инфекционного заболевания может зависеть здоровье и жизнь животного, поэтому  быстрая  диагностика  позволит назначить адекватное лечение в минимальные сроки.

Принцип  работы   экспресс-тестов  основан  на  методе  иммунохроматографии (ИХА),  сущность  которого  заключается  в  следующем:  при  нанесении  исследуемого  образца  жидкости (сыворотка  крови, смывы со слизистых)  на  специальную  нитроцеллюлозную мембрану    на  которой закреплены специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены),  раствор с исследуемым биологическим материалом проходит вдоль мембраны  за  счет  капиллярных  сил.  В  случае  присутствия  в  исследуемом  материале  тестируемого  антигена   или  антитела  происходит    связывание  с  агентами  на  подложке (мембране).   В  результате  чего  на  мембране   появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие о негативном или позитивном результате теста.

В настоящее время существуют экспресс-тесты для диагностики ряда заболеваний, таких как:   парвовирусный  энтерит  собак,  чума  плотоядных,  панлейкопения  кошек,  вирусный иммунодефицит  кошек,  вирусная лейкемия  кошек, калицивироз кошек,  дирофиляриоз,  анаплазмоз,  болезнь  Лайма,  а  также  некоторых  гормонов   и   ферментов. 

Еще  одним иммунологическим  методом   с  использованием  нитроцеллюлозной  мембраны  является  иммуноблотинг.  Сначала   сложные  смеси  белков,  например,  с  поверхности  вирусной  оболочки,  разделяют  методом  электрофореза в полиакриламидном  геле. Затем  разделенные  белки  переносят  на  нитроцеллюлозную  мембрану. Далее  не специфически  связанные с  мембраной  антигены  могут  быть  идентифицированы  с  помощью  меченых  антител.  Данный  метод  получил  широкое  распространение  в  лабораторной  диагностике  заболеваний  человека  (например  ВИЧ-инфекции),  а  также  в  научно  исследовательских  работах. 

Таким  образом,  иммунологические методы,  используемые в   клинической практике  и  экспериментальных исследованиях,  очень  разнообразны.  Многие  из  них  являются  методами  экспресс-диагностки  и  позволяют  в  кратчайшие  сроки  провести  анализы  на  инфекционные  заболевания  или  оценить  иммунный  статус   животного  или  человека. 

Светлакова Е. С. 
Ветеринарный врач-лаборант 
лаборатории «BIOVETLAB».

Диагностика бактериальных заболеваний

Бактериальные заболевания – это группа заболеваний, вызываемых проникновением в организм патогенных (болезнетворных) микроорганизмов. Ранняя и точная диагностика бактериологических заболеваний имеет большое значение для назначения и проведения адекватной терапии.

Методы лабораторной диагностики в ветеринарии

На сегодняшний день методы лабораторной диагностики в ветеринарии довольно многочисленны, и продолжают расширяться. Применяют их главным образом для подтверждения диагноза или его уточнения, установления причины болезни, для характеристики формы, тяжести течения и определения прогноза болезни, для выбора этиологической и патогенетической терапии, для оценки и контроля результатов лечения, а также для обнаружения патологии при скрининговых исследованиях.

ЭТО ИНТЕРЕСНО: